二、TOPO克隆PCR产物的纯化及回收

1. 在完成PCR反应后，产物应通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，以确认是否存在预期大小的DNA条带。

2. 推荐采用切胶回收法进行纯化。切胶时间建议控制在3分钟以内，以避免紫外照射对DNA的损伤。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，确保浓度达到≥30ng/μl，同时再次通过电泳确认仅存在目的DNA条带。

3. 将目的片段连接至载体。连接反应体系应按说明书要求添加，各组分的投入体积不应少于1μl，若浓度过高可先进行稀释。连接反应温度可以尝试设置为25°C或37°C，时间为5分钟。如果遇到克隆失败或假阳性问题，可适当延长时间至30分钟。

4. 感受态细胞转化与涂板操作：

1. 推荐使用DH5α或Fast-T1等化学感受态细胞进行连接产物的转化。

2. 感受态细胞不可反复冻融，建议从-80°C取出后一次性使用完毕。

3. 重组产物体积与感受态细胞体积的比例为1:10，推荐将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或将5μl重组产物加入至50μl感受态细胞。

4. 热激时间应按照感受态细胞的说明书进行操作。

5. 涂板时使用的抗生素抗性应与转化载体的抗性保持一致。

6. 涉及菌液涂板，用2500×g离心3分钟后，弃去多余的LB培养基，保留100μl重悬液后全部涂板，或吸取适量涂板。

5. 单克隆菌落的PCR鉴定：

1. 从平板中挑取适中大小的单克隆菌落，避免选择尺寸过大或过小的菌落。

2. 挑选多个单克隆菌落进行鉴定分析。

3. 将挑选的菌落放入已加入10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中，充分混匀后吸取1-2μl作为PCR反应的模板（10/20μl体系）。

4. 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。

6. 针对含有Amp/kana抗性的质粒进行目的片段的切胶回收。

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