细胞培养条件说明

培养条件气相采用95%空气和5%二氧化碳，温度设定为37℃，使用DMEM培养基配合10% FBS和1% P/S进行贴壁培养。A-673细胞系来源于一位15岁女性的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂中形成克隆，并在经过免疫抑制血清处理的小鼠体内形成肿瘤，其细胞中具备四个以上的标志染色体，并且存在额外的F染色体及两个异常的B染色体。

细胞传代与培养指导

根据首次传代的建议，按照1:2的比例进行传代，每2天更换培养液。建议同时购买细胞的完整培养器材，以获取更大的优惠。获得细胞后，需及时处理，以确保其处于良好状态，直至瓶口密封，这样便是运输细胞过程中最好办法。

当细胞到达时，应使用75%酒精对整个细胞瓶表面进行喷洒消毒，然后放置于超净台中，严格实施无菌操作。接着把细胞瓶置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态再进行后续处理。使用显微镜观察细胞生长情况，并在不同倍数下拍摄照片保存（建议40x, 100x, 200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，如果未提供照片则默认收到的细胞状态良好。

细胞培养步骤

细胞传代：当细胞未达到80%汇合度时，应将培养瓶中的完全培养液收集入离心管中，保留5ml的完全培养基，并继续在37℃、5% CO2的孵箱中培养。如果细胞密度超过80%，则可进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS洗涤细胞1-2次。2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞变化，一旦大部分细胞变圆并脱落，迅速回操作台，轻轻敲击培养瓶后加入超过5ml的完全培养基以终止消化。3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后，吸出悬液并转移至15ml的离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液后加入1-2ml的完全培养基进行重悬。4. 将细胞悬液按1:2的比例分装入两个T25瓶中，并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后将其放入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养。

悬浮细胞的传代步骤：1. 半换液法：将培养瓶竖立在培养箱中静置约1小时，轻轻吸掉约3ml的培养基，随后加入3ml的完全培养基。如果培养基变色缓慢，可直接添加约500ul的FBS。传代时也可直接补给5ml培养基，并分到两个培养瓶中，通常进行3次后可进行离心传代，去掉死细胞。2. 离心换液法：如需分瓶，将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液重悬均匀后，将细胞悬液按1:2的比例分装到新的T25瓶中，添加6-8ml的新完全培养基以保证细胞的生长活性。

细胞冻存及复苏

细胞冻存：1. 当细胞覆盖培养瓶的80%面积时，弃去培养液并使用PBS清洗细胞一次。2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放在显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基以终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，随后转移至15ml离心管中进行1000RPM的离心5分钟。3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的无血清冻存液（如不朽情缘MG的产品），混匀后转入冻存管中。4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱存放。如需转入液氮罐，需在-80℃冰箱中保存24小时以上再进行转移。

细胞复苏：1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护用具），迅速放入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无冰晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，并接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养。4. 次日更换为新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项

某些细胞可能在运输过程中容易脱落，这是正常现象。如果细胞脱落数量较多，可以将培养瓶内的培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养，再次沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打以重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止消化，再离心处理。这样可在按1:2的比例进行传代时，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，并存放于37℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养。